色谱柱
关于HPLC分析方法的开发，常常需要专业知识与经验，并消耗大量时间与精力。加快方法开发有助于提升研发速度。通过将可全面考察分离条件的方法筛选流程标准化，任何人都可以更轻松、快速地完成方法开发。
进行方法开发时，如图所示，化合物性质、固定相（色谱柱/填料）和流动相是显著影响分离的三大要素。
由于待分离化合物本身无法改变，因此主要从固定相和流动相两个方向进行条件优化。
开始方法摸索前，应先收集化合物和分析条件等信息。如有可参考的分离案例，可在其基础上进行优化；如缺少参考信息，方法筛选是一种有效手段。方法筛选可系统考察流动相、色谱柱等分析条件，并在确定基本条件后进一步优化流动相和色谱柱规格，从而快速完成方法开发。
反相HPLC方法筛选中，除流动相中的有机溶剂外，缓冲液（水溶液）的pH也会显著影响分离，因此需要考察的项目较多。为缩短筛选时间，可使用长度50 mm的短柱。Triart系列具有良好峰形和卓越耐久性，并提供丰富的筛选用尺寸。通过组合Triart色谱柱、有机溶剂和流动相pH，可快速完成方法初筛。
色谱柱和流动相基本条件的选择
分离条件优化（最终方法设定）
根据方法初筛结果进行条件优化。通过考察流动相比例、梯度斜率、第二种有机溶剂的添加及柱温等条件，改善并优化分离度和保留时间。
分析多组分样品时，梯度洗脱通常较为有效，但每次分析均需预留平衡时间。优化梯度时，应以强保留组分能够洗脱为依据确定最终组成，并以弱保留组分能够获得适当保留为依据确定初始组成。需要提高分离度的区间可减缓梯度，需要加快洗脱的区间可增大梯度，从而改善分离并缩短分析时间。
从方法筛选的梯度结果转为等度洗脱时，可从比梯度条件下最早组分洗脱时的有机溶剂浓度低约20%的条件开始考察。
市售感冒药提取液分析中的梯度斜率优化案例
| Column | Hydrosphere C18 (5 μm,12 nm) 150 X4.6 mmI.D. |
|---|---|
| Eluent | A) 20 mM phosphate buffer (pH 2.5) B) methanol |
| Flow rate | 1.0 mL/min |
| Temperature | 37 ℃ |
| Detection | UV at 210 nm(0-15 min), 235 nm (15-25 min) |
需要进一步改善分离时，添加四氢呋喃等第二种有机溶剂有时会有效。在有机溶剂总量不变的情况下，用第二种有机溶剂替换其中一部分，可改变选择性并改善分离。
