技术信息
以寡核酸为药效主体的核酸药物可作用于低分子药物和抗体药物难以覆盖的细胞内靶点，并可通过化学合成生产。当前多数核酸药物会采用硫代磷酸酯化等修饰，以提高核酸酶耐受性和细胞递送能力。以下介绍硫代磷酸酯型寡核酸的离子对反相分析要点。
寡核酸带负电荷，通常使用 TEA 或 DIPEA 等兼具正电性基团和疏水基团的离子对试剂，使其形成电中性的离子对后在反相填料上分离。HFIP 常用作酸性改性剂，可改善分离与 LC-MS 灵敏度；TEA-HFIP 与甲醇的相容性优于乙腈。
| 流动相 | 烷基胺种类与浓度、酸性改性剂、有机溶剂 |
|---|---|
| 色谱柱 | 固定相种类、色谱柱硬件 |
| 其他条件 | 柱温、梯度斜率 |
使用 TEA-HFIP 分析 20mer 和 21mer 硫代磷酸酯型寡核酸时，提高 TEA-HFIP 浓度可改善分离并使峰形更尖锐。
| Column | YMC-Triart Bio C18 (1.9 µm, 30 nm), 50 X 2.1 mmI.D. |
|---|---|
| Eluent | A) TEA-HFIP aqueous solution B) methanol 8-18%B (0-10 min) |
| Flow rate | 0.42 mL/min |
| Temperature | 65°C |
| Detection | UV at 260 nm |
随着柱温升高，20mer 和 21mer 硫代磷酸酯型寡核酸的峰形趋于尖锐，但温度过高时峰形会恶化。不同序列的温度依赖性不同，需要逐一确认合适条件。
| Column | YMC-Triart Bio C18 (1.9 µm, 30 nm), 50 X 2.1 mmI.D. |
|---|---|
| Eluent | A) 15 mM TEA-400 mM HFIP B) methanol |
| Gradient slope | 1%B/min |
| Detection | UV at 260 nm |
寡核酸的磷酸基容易吸附于金属表面，引起峰展宽、残留以及定量性和 LC-MS 灵敏度下降。采用生物惰性硬件的 Accura Triart 可抑制金属吸附，获得更高峰高和更好的分析灵敏度。
| Column | 1.9 µm, 30 nm, 50 X 2.1 mmI.D. |
|---|---|
| Eluent | A) 15 mM TEA-400 mM HFIP B) methanol 8-18%B (0-10 min) |
| Temperature | 65°C |
| Detection | UV at 260 nm |
